5mL Wako-LAL試劑
LIMUSATEÒ - U.S. License No. 1762
50 tests vial
使用說明書
一、 使用目的：(INTENDED USE)
LAL試驗使用凝膠法供定性測定革蘭氏陰性細菌性內毒素之用。 根據美國藥典(USP Bacterial Endotoxines Test)及美國FDA公佈之LAL試驗指引(U.S. FDA Guideline for LAL testing)提供標準的方法供確效LAL試驗以供替代兔子熱原(Pyrogen)試驗。
LAL試劑使用凝膠法供定性測定革蘭氏陰性細菌性內毒素之用。 LAL試劑是測定熱原最敏感和最明確的方法，內毒素是一種革蘭氏陰性細菌產生熱病的副產品，俗稱熱原(Pyrogen)。
USP對於一般醫療及藥品用水內毒素的限制是：Water for Injection and Sterile WFI的限制是0.25EU/mL， Bacteriostatic WFI的限制是0.50EU/mL， Sterile Water for Inhalation的限制是0.50EU/mL， Sterile Water for Irrigation的限制是0.25EU/mL。 一般注射用藥的限制是每公斤(KG)劑量5EU(Endotoxin Unit)，請參閱LAL Regulatory Guidelines， 並規定椎管內的用藥(intrathecal drugs)限制是2EU/KG。 一般醫療器材不得超過0.5EU/mL；但是應用接觸到腦與脊隨液(cerebrospinal fluid)的醫療器材的限制是0.06EU/mL。
二、 試劑儲存指示：(STORAGE INSTRUCTIONS)
請LAL試劑儲存於低於0℃的冰箱，CSE內毒素標準品請儲存於低於4℃的冰箱之中。 水化之後的LAL試劑在使用時請將LAL試劑瓶放置在冰塊或乾冰(Refrigerant)上來使用而且必需在8小時內使用。 其他多餘的水化之後的LAL試劑請儲存於低於-20℃的冰箱中可長達兩星期之久(根據美國FDA Reference Lysate參照LAL的儲存條件標準)。
三、 試劑準備：(Reagent Preparation)
A.水化再製(Rehydrate)LAL試劑：用輕敲試劑瓶側面及底部的方法將LAL試劑粉集中
於試劑瓶底部。 在使用之前將LAL試劑瓶上的金屬及橡膠封蓋打開並立即使用無熱原吸量管將5mL的無熱原水(LAL Reagent Water)直接加入LAL試劑瓶中。 用原來的塞子蓋緊。溫和的混合LAL試劑一直等到LAL試劑溶解為止。 避免接觸封蓋的裡面或內側。在作試驗時請將LAL試劑保持在2℃到8℃之間。 請使用相同的無熱原水來水化LAL試劑和標準內毒素(CSE)。
B.水化再製(Rehydrate)CSE內毒素標準品：用輕敲試劑瓶側面及底部的方法將CSE
內毒素標準品集中於試劑瓶底部。 在使用之前將CSE內毒素標準品瓶子上的金屬及橡膠封蓋打開並立即使用無熱原吸量管將2mL的無熱原水(LAL Reagent Water)直接加入CSE內毒素標準品瓶中。用原來的塞子蓋緊。同時用渦狀漩轉(vortex)20分鐘。
1.根據分析證明書(COA)提供的資料，準備1EU/mL的CSE內毒素標準溶液。
2.使用這個1EU/mL的CSE內毒素標準溶液，如表格1中所示準備endotoxin 稀釋
系列。來準備。1個EU/ml CSE 解決辦法，如表格1中所示的內毒素稀釋序列。同時在每一稀釋序列之間請渦狀漩轉(vortex)每一試管30秒鐘。 如果可能的話，LAL試劑和CSE內毒素標準品稀釋時請使用相同的無熱原水(LAL Reagent Water)。
表格1--內毒素稀釋法：
|
稀釋前內毒素濃度 (EU/mL) |
內毒素加無熱原水 (mL) |
稀釋後內毒素濃度 (EU/mL) |
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1 |
1+1 |
0.5 |
|
0.5 |
1+1 |
0.25 |
|
0.25 |
1+1 |
0.125 |
|
0.125 |
1+1 |
0.06 |
|
0.06 |
1+1 |
0.03 |
|
0.03 |
1+1 |
0.015 |
3. 這個水化的內毒素標準品濃度在1EU/mL以上的可儲存在2-8℃冰箱中達到14天之久(根據美國FDA Reference Endotoxin參照內毒素的儲存條件標準訂定)。 水化的標準內毒素標準品濃度在1EU/mL以下的可儲存在2-8℃冰箱中24小時。
四、 樣品採集和準備：(Specimen Collection and Preparation)
必需使用可去除熱原材質的器具和無內毒素的試劑(endotoxin-free reagents)來採集樣品供LAL試劑。所有接觸到樣品及試驗材料的器材都必需無內毒素(endotoxin-free)。玻璃器具可以使用可資證實的250℃高溫條件來處理(exposure)30分鐘來去除所有玻璃器具上的內毒素。 拋棄式經過滅菌確效且標示有(sterile and disposable)的塑膠器具亦可使用。 根據經驗那些標示有(sterile and disposable)的塑膠器具是(endotoxin-free)無內毒素的。
LAL試劑凝集試驗最佳的pH值是介於6.75-7.5之間。 如果需要調整pH值的話，請使用適當濃度無熱原的HCL或NaOH來加以調整(一般來說使用0.1N或更少量即可)。
準備無熱原的NaOH溶液，請使用無菌的操作技術在一個無熱原的容器中使用無熱原水來溶解適量的純NaOH顆粒狀物資。並使用高溫高壓鍋(Autoclave)在15-17psi中滅菌一小時。將消毒過的NaOH溶液儲存在冰箱中。
準備無熱原的HCL，請使用無菌的操作技術在一個無熱原的容器中使用無熱原水來稀釋適量的濃縮的HCL。並使用高溫高壓鍋(Autoclave)在15-17psi中滅菌一小時。將消毒過的HCL溶液儲存在冰箱中
五、 提供的試劑：(Material Provided)
冷凍乾燥的LAL試劑和標準內毒素CSE。
六、 其他需要的試劑和材料：(Material Required But Not Provided)
無熱原水(LAL Reagent Water LRW100)：必需使用無熱原水(與LAL試劑不起任何作用反應)來水化LAL試劑及準備CSE內毒素標準品來作陽性比對(positive control)。
內毒素標準品(Control Standard Endotoxin E1000)：內毒素標準品(CSE)必需用來供確認LAL試劑的敏感度，確效產品試驗的方法，準備陽性比對(positive controls)和內毒素標準溶液。 請參照每一批內毒素標準品(CSE)的分析證明書(Certificate of Analysis)的力價，水化，及儲存等資訊。 內毒素標準品(CSE)是與LAL試劑分開訂購的。 渦狀混合機(vortex mixer)是最適合用來混合內毒素溶液及其後的稀釋步驟。
水浴槽(water bath)或恆溫槽(heating block)：需要在37℃溫度(±1℃)的環境中培養LAL試劑混合物。 需要無菌的、無熱原的配件包括；10x75mm的硼矽酸鹽玻璃試管供LAL凝膠鑑定試驗之用，13x100mm可供稀釋使用的硼矽酸鹽試管或同級的試管(附蓋子的)，一支機械式校準過的吸注器(pipette)並使用無菌、無熱原、可拋棄式的塑膠吸管尖(pipette tips)供吸取少於1mL的量，及一些較大的吸量管(pipettes)供吸取較大的液量(1, 5, 或10mL)。也需要試管架供放置反應試管(reaction tube)和內毒素標準品稀釋液試管。 定時器供測量培養時間及內毒素混合時間的間隔。
七、試驗步驟：(TEST PROCEDURE)
LAL試驗的基本測試過程是由使用一個0.1mL的樣品在一支10x75mm無熱原(pyrogen-free)的玻璃試管中與0.1mL的LAL試劑混合同時在37℃(±1℃)水浴槽(water bath)或恒溫槽(dry bath)中不受干擾的培養60分鐘(±2分鐘)所組成。 在培養60分鐘完成之後，用目視的方法來檢視是否呈現或沒有一個凝固的凝膠。所有玻璃器皿和其他材料或器材用來直接的與LAL試劑接觸的一定是要用無熱原的器材。 不可以用衛生紙，面紙，棉花，羊毛布或布來擦拭吸管尖(pipette tips)，因為它們可能受到熱原污染的。
1. 將0.1mL的受試樣品直接吸取及注入一支空的10x75mm無熱原的玻璃試管的底部。
若經由試管的內側管壁注入樣品，受試樣品會被試管的內側管壁吸收而造成受試樣品明顯的損失。
2. 針對上述試管加0.1mL的LAL試劑。避免直接接觸到受試樣品免得不小心被汙染。可
注入玻璃試管比較底部的試管內側管壁注入樣品。
3. 用無熱原的鋁箔片封蓋試管口。 溫和的將裡面的東西混合好，但是避免讓它們起
泡沫。
4. 將這個玻璃試管直立的放入37℃(±1℃)水浴槽(water bath)或恒溫槽(dry bath)中
不受干擾的培養60分鐘(±2分鐘)。 由於LAL試劑對於溫度的反應是非常敏感的，培養箱的溫度必須小心的監測。並且凝膠形成的反應也是靈敏而脆弱的而且假如試管在培養期間受到碰撞或敲擊等擾動干擾的話也可能是無法恢復改變的。
5. 在培養60分鐘完成之後，用目視的方法來檢視是否呈現或沒有一個凝固的凝膠。
八、結果判讀：(INTERPRETATION OF RESULTS)
每一支鑑定試管在凝膠法(Gel-clot)中只被判定為陽性(Positive)或陰性結果(Negative)。
陽性結果(Positive test)：陽性試驗結果定義為形成固結的凝膠當試管翻轉180°時
仍能保持固結完整不掉落。
陰性結果(Negative test)：陰性試驗結果的特性是沒有形成凝膠(Gel)或只是形成一
團黏塊，當試管翻轉180°時無法固定在原來位置而掉落。
九、LAL試劑的品質控制：(Quality Control of LAL)
LAL試劑的品質控制建議在每天作LAL試驗之前，或與內毒素標準品(CSE)要作第一次序列試驗時一起作以確保LAL試劑和試驗系統如預期般的運作正常。例如，標示敏感度為0.25EU/mL的LAL試劑，要針對0.50EU/mL，0.25EU/mL，0.125EU/mL，0.06EU/mL的內毒素標準品(CSE)和陰性比對(negative controls)作測試。 試驗結果0.50EU/mL必需是陽性反應，0.25EU/mL則是陽性或陰性反應，0.125EU/mL也是陽性或陰性反應，但是0.06EU/mL和陰性比對(negative controls) 則必需是陰性反應才是有效的試驗。
附註:如果0.25EU/mL是陰性反應,而0.125EU/mL是陽性反應的話,這個試驗是無效的。
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中華民國 九十九 年 四 月 九 日 校譯